當(dāng)前位置：微生物細(xì)胞具有多種酶系統(tǒng)，利用微生物細(xì)胞作為多種酶源，用固定化酶的制備方法，將微生物細(xì)胞體進(jìn)行固定，從某種意義上可獲得比固定化酶更好的效果。
微生物細(xì)胞的一般固定方法
固定化活細(xì)胞的制備方法主要有物理吸附法和包埋法兩種。
１．物理吸附法
帶電的微生物細(xì)胞和載體之間的靜電相互作用，使細(xì)胞體吸附固定在硅藻土、木材、玻璃、陶瓷和塑料等載體上。如酵母細(xì)胞是帶負(fù)電的，在固定時(shí)要選擇帶正電的載體。在ｐＨ為４時(shí)，熱帶假絲酵母、釀酒酵母等在陶瓷表面上的吸附程度較大，載體表面的４０％～７０％被細(xì)胞牢固吸附，不會被高流培養(yǎng)液沖掉。載體的性質(zhì)也影響細(xì)胞與載體之間的相互作用，主要是載體的成分、表面電荷、表面積和ｐＨ的影響。所有的玻璃和陶瓷都是由不同比例的氧化硅、氧化鎂等組成的，如將玻璃等放在溶液中，在它的表面會發(fā)生離子交換，形成不再是鋁、硅等的氧化物，而為相應(yīng)的氫氧化物。載體表面的羥基可被微生物細(xì)胞表面的氨基或羧基所取代，在細(xì)胞與載體之間形成鍵。物理吸附法固定化活細(xì)胞的酶活性不受影響，但吸附過程相當(dāng)復(fù)雜，吸附過程與微生物的性質(zhì)、載體的特性及細(xì)胞與載體之間發(fā)生的相互作用有關(guān)，只有這些參數(shù)配合恰當(dāng)時(shí)才能形成穩(wěn)定的微生物細(xì)胞———載體復(fù)合物。
物理吸附法固定微生物細(xì)胞現(xiàn)已廣泛用于廢水處理工程———生物膜法，中國科學(xué)院微生物研究所應(yīng)用自養(yǎng)菌和異養(yǎng)菌的混合菌，吸附于玻璃鋼蜂窩填料繁殖成生物膜，用以處理含硫氰酸鈉的腈綸廢水。北京工業(yè)大學(xué)應(yīng)用馴化的混合菌吸附于活性炭的大孔及其表面，用以處理印染廢水等。
２．包埋法
將微生物細(xì)胞用物理的方法包埋在瓊脂、海藻酸鈉、明膠、聚丙烯酰胺和（ＰＶＡ）等凝膠載體內(nèi)，使微生物細(xì)胞固定化。一般的包埋成形法比較復(fù)雜，機(jī)械性能差、易磨損，不適于大批量。因而近年來一些學(xué)者又研究了一種制備珠型固定化細(xì)胞技術(shù)。
（１）瓊脂凝膠包埋法。稱取４ｇ瓊脂或瓊脂糖溶于５０ｍｌ０.２ＭｐＨ為７.０的磷酸緩沖液中，加熱溶解后，冷卻到５５℃左右，將細(xì)胞濃度為６０％左右的細(xì)菌懸浮液于４０℃下保溫，然后與瓊脂溶液混合均勻。用注射器針頭將熱的混合液滴入冷的甲苯溶液、四氯乙烯溶液或液體石蠟內(nèi)，冷卻形成２～３ｍｍ直徑的小球。或?qū)岘傊?細(xì)菌混合液流加到攪拌下的５００ｍｌ３０℃的醋酸丁酯中，加完后繼續(xù)攪拌３分鐘，到混合物分散成小滴，迅速加入３００ｍｌ冷的醋酸丁酯，再攪拌２～５分鐘，傾去醋酸丁酯，抽濾干，用緩沖液洗至無醋酸丁酯味，即制成珠型固定化細(xì)胞，小珠１～３ｍｍ。使用前將球形固定化細(xì)胞放入消毒好的營養(yǎng)液中３０℃下活化２４小時(shí)后再用。
（２）海藻酸鈣凝膠包埋法。稱取２ｇ海藻酸鈉，加３０ｍｌ生理鹽水于高壓滅菌鍋中加熱溶解、冷卻到４０℃，取２０ｍｌ與２０ｍｌ細(xì)胞濃度為５０％的細(xì)菌懸浮混合均勻，然后用注射器針頭滴加到0.１Ｍ氯化鈣或４％的氯化鋇溶液中，邊滴邊搖，使其形成２ｍｍ直徑球型小珠，然后用生理鹽水洗滌。或?qū)⒒旌弦毫骷拥綌嚢柘碌模玻埃啊担埃埃恚齑姿岫□ブ校?dāng)分散成小滴后，迅速加入５ｍｌ０.１Ｍ的氯化鈣溶液，繼續(xù)攪拌５～１０分鐘，自然沉降，傾去醋酸丁脂，再加入５０ｍｌ０.１Ｍ的氯化鈣溶液，浸泡１小時(shí)，進(jìn)一步固化，然后用蒸餾水*洗滌，即得直徑為１～３ｍｍ的珠型固定化細(xì)胞。干后可保存于低溫下，使用前需放入消毒好的營養(yǎng)液中３０℃下活化２４小時(shí)后再用。由于磷酸鹽會破壞凝膠的結(jié)構(gòu)，因而在使用海藻酸鈉固定細(xì)胞時(shí)盡量防止磷酸鹽的加入。
（３）明膠包埋法。稱取６ｇ明膠，加入５０ｍｌ０.１ＭｐＨ為７.０的磷酸緩沖液，加熱溶解后冷卻至４０℃，取２０ｍｌ與２０ｍｌ細(xì)胞濃度為６０％的細(xì)菌懸液在４０℃混合均勻，冷卻凝固后切成１～２ｍｍ３方塊，然后再加２.５％戊二醛，使包埋塊懸浮在戊二醛溶液中，室溫下輕輕攪拌４小時(shí)進(jìn)行交聯(lián)，濾去戊醛后，逐次用０.１Ｍ氯化鈉和去離子水洗滌后即成。或者將明膠菌體混合液流加到２００ｍｌ２０℃攪拌下的醋酸丁酯溶液中，當(dāng)分散成小珠后，迅速加入５ｍｌ５％的戊二醛溶液，繼續(xù)攪拌５～１０分鐘，傾去醋酸丁酯，水洗即得到珠型固定化細(xì)胞，再放入５０ｍｌ的ｐＨ為５.０的戊二醛溶液中浸泡３０分鐘，然后*洗滌，即獲得直徑１～３ｍｍ的球形小珠。使用前將其放入營養(yǎng)液中３０℃下活化２４小時(shí)后再用。用戊二醛交聯(lián)的明膠包埋法，可獲得機(jī)械強(qiáng)度及工作穩(wěn)定性較好的固定化細(xì)胞。
（４）聚丙烯酰胺凝膠包埋法。此法是較常用的一種包埋法。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺在催化劑作用下聚合形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。常用的催化劑和加速劑是過硫酸銨和四甲乙二胺或三乙醇胺。
稱取１７.６ｇ丙烯酰胺和１.２ｇＮ Ｎ′甲叉雙丙烯酰胺溶于０.０５ＭｐＨ為７.０的ＴｒｉｓＨＣｌ緩沖液中，取２０ｍｌ與５ｇ的濕菌泥混合均勻，加入５０ｍｌ的４０％過硫酸銨，混合均勻后流加到攪拌的豆油或液體石蠟中，攪拌分散成小滴，迅速加入２５０ｍｌ的四甲基乙二胺，小滴即很快聚合形成小珠，傾去流體，用水或緩沖液充分洗滌即可獲得珠型固定化細(xì)胞。或?qū)⒕嗷旌弦杭尤耄保ミ^硫酸銨０.２５ｍｌ和１０％三乙醇胺４ｍｌ，將上述混合液攪拌均勻，不要出現(xiàn)氣泡，置于４０℃恒溫浴中３０分鐘左右，即形成聚丙烯酰胺凝膠固定化細(xì)胞，在凝膠未干時(shí)切成２～３ｍｍ３小塊，于５０～６０℃中干燥后保存。使用前將包埋好的固定化細(xì)胞放入消毒后的營養(yǎng)液中活化２４小時(shí)再用。
